第二节   猪应激综合征的生理学和遗传学基础

    一、猪应激综合征的生理学基础

    肌肉的收缩、舒张和能量代谢都要受到肌浆网中 Ca²⁺ 浓度调节，即 Ca²⁺ 的浓度改变同步的调控肌肉收缩和能量代谢两个过程。当肌肉静息时，肌浆中 Ca²⁺ 的浓度约为10^-8 M ，此浓度既不能激活磷酸化酶 b 激酶，也不能激活肌动球蛋白 ATP 酶。而肌浆网内 Ca²⁺ 的浓度却高达 10^-3 M 左右，这是由于肌浆网上的钙泵逆浓度差将肌浆中 Ca²⁺ 泵入肌浆网内，而肌浆网的膜又不允许Ca²⁺ 自由通过之故。当动作电位沿横管膜到达肌浆网时，引起肌浆网对 Ca²⁺ 的通透性瞬间增高，结果 Ca²⁺ 顺着巨大的浓度差冲入肌浆，使肌浆中 Ca²⁺ 的浓度达到 10^-6 M 左右。此浓度正好激活肌动球蛋白 ATP 酶及磷酸化酶 b 激酶，同时激活糖酵解过程，从而引起肌肉收缩和糖原分解及糖酵解。动作电位刚过，肌浆网即不允许Ca²⁺ 自由透过，并由钙泵将 Ca²⁺ 泵入肌浆网，使肌浆网中 Ca²⁺ 的浓度又降至 10^-8 M 左右，灭活肌动球蛋白 ATP 酶，于是肌肉处于舒张状态。

    骨骼肌肌浆网中的 Ca²⁺ 释放通道已经先后定位于肌纤维中和 “ 重 ” 肌浆网的空泡内。 Ca²⁺ 释放通道由蛋白质构成，其粘性很高，一种称为兰尼啶(ryanodine)的植物碱粘附在上面，控制着 Ca²⁺ 通道的开关。 Ca²⁺ 释放通道是兰尼啶与细胞结合的唯一部位，故前者又被称为兰尼啶受体(ryanodine receptor ， RYR)。兰尼啶受体又分为三种同分异构体：骨骼肌兰尼啶受体(RYR1)、心肌兰尼啶受体(RYR2)和大脑兰尼啶受体(RYR3)。

    Brenig 等通过分离肌肉特异的参与形成肌肉收缩的受体，认为在兴奋传异和肌肉收缩过程中，二氢吡啶受体(dihydropyridine receptor ， DHPR)和兰尼啶受体(RYR1)起着决定性作用(兴奋收缩耦联)。 DHPR 位于横管膜(transverse tublar membrane)上，位于肌浆网(SR)的终端池内的 RYR1 上面，在细胞质间隙中相互连接。作为压力传感器，传导肌纤维膜的去极化。当 DHPR 兴奋时， RYR1 的 Ca²⁺ 通道开放，肌纤维上的 SR 释放Ca²⁺ 导致肌肉收缩。而 Mg²⁺ 和钙调节蛋白(Calmodulin)则抑制了 Ca²⁺ 释放通道的开启， MHS 的解救药硝苯呋海因(dantrolene)则抑制氟烷诱导和 Ca²⁺ 诱导肌浆网中的 Ca²⁺ 的释放。不过，硝苯呋海因与 Ca²⁺ 释放通道的直接的相互作用尚未得到证实。

    Ca²⁺ 的释放是一系列反应的最终结果。这些反应包括神经、肌肉和横管膜的去极化，以及与横管膜上的 Ca²⁺ 慢通道(二氢吡啶受体)有关的电荷运动及 Ca²⁺ 释放通道的开放。参与这些反应的许多蛋白质已经搞清楚，不过，肯定尚有一些蛋白质有待查明。钙泵、质膜物质交换和线粒体膜物质运输受 Ca²⁺ 调节，并参与肌细胞内 Ca²⁺ 调节。分离 SR 的电生理学实验表明， MHS 敏感个体的 RYR1 终端池的 Ca²⁺ 非正常迅速释放。由此推断， RYR 的缺陷(或骨胳肌内 Ca²⁺ 调节异常)是导致 MHS 的原因。尤其是肌细胞内 Ca²⁺ 积累导致肌肉收缩，增强糖酵解和有氧代谢，从而可能消耗 ATP 、葡萄糖和氧气，而产生过多的 CO₂ 、乳酸和热量，并使细胞内外离子平衡紊乱，而导致应激敏感猪出现恶性高热综合征。 Ueda 等通过模拟试验证实， Ca²⁺ 浓度的提高能直接产生过多的热量。其原因是过多的 Ca²⁺ 将液态的磷酯膜转变为固态，类似于水的结冰作用，能释放潜在的热量。

    细胞内 Ca²⁺ 浓度失调导致恶性高热，而这种失调可能是由于编码钙泵、 Ca²⁺ 释放通道或其它参与兴奋一收缩耦联的蛋白质的控制基因发生突变所致。生化研究已经排除了 Ca²⁺ 泵发生异常的可能性。但是，从人和猪的肌肉样本中已经观察到，低 Ca²⁺ 浓度时， Ca²⁺ 诱导 Ca²⁺ 释放速率高，而高 Ca²⁺ 浓度时，应激敏感猪 Ca²⁺ 通道的关闭受到抑制。应激敏感猪肌浆网兰尼啶结合力增强，其程度依赖于 Ca²⁺ 释放通道开放状态。

    二、猪应激综合征的遗传学基础

    经典遗传学分析表明：猪应激综合征受常染色体的单一位点隐性基因(氟烷敏感基因，halⁿ)控制，呈简单的孟德尔式遗传方式，且具有可变的外显率(penetrance)和表现度(expressivity)。其基因型有 3 种：Hal^NN、Hal^Nn和Halⁿⁿ，Hal^NN和Hal^Nn 表型为氟烷阴性(HN)， Halⁿⁿ 表型为氟烷阳性(HP)。美国 Iowa 实验站的研究对于 halⁿ 基因隐性遗传理论提供了有利证据(表 1)。但， Carden 等认为氟烷敏感性受两个位点控制，一个氟烷敏感位点(halⁿ)和一个抑制位点(supresser locus)，抑制位点的隐性纯合子能抑制氟烷位点隐性纯合子的表达。遗憾的是该假说并未得到进一步证实。

表 1 不同配种类型的后代氟烷反应

    Halⁿⁿ 的外显率受遗传和环境影响。不同的品种、品系和猪群外显率不同，变化范围为 50%-100% ，平均为 89% 。 Carden 等发现 Hal^Nn 部分个体呈氟烷阳性反应，如英国长白猪的杂合子中 22% 的个体是氟烷阳性。可能的原因是 N 对 n 显性不完全或存在母系遗传(maternal inheritance)，或者线粒体遗传(mitochondrial inheritance)。影响 Hal nn 外显率的环境因素主要有供试猪年龄、性别、耐受性、环境温度和判定标准等。

    随着分子生物学技术的发展，将 RYR1 基因作为猪应激综合征的候选基因进行研究。 RYR1 基因全长至少 240kb ，约含 100 个外显子。猪 RYR1 基因 cDNA 全长 15253bp ，编码 5034 个氨基酸，在 3' 末端有 151bp 非编码区。并认为 RYR1 基因可能就是 Hal 基因，被精确定位于猪染色体 6q^1.1 -q^2.1 上。

    Fujii 通过比较应激繁感猪皮特兰(Hal^nm)和非应激猪约克夏(Hal^NN)全长 RYR1cDNA 序列 , 发现全长约 15kb 范围内有 18 处碱基差异(表 2)，唯有 RYR1 基因 1843 碱基 C (胞嘧啶)突变为 T (胸腺嘧啶)，导致编码氨基基 Arg⁶¹⁵ →Cys 。而 Arg⁶¹⁵ 被认为位于 Ca 2+ + 释放通道的表面，且为胰蛋白酶的裂解点，即将 99KD 的兰尼啶受体蛋白裂解为 86KD 和 13KD 两个功能多肽。一旦发生 Arg⁶¹⁵ →Cys 突变时，兰尼啶受体蛋白就不能发生正常裂解，从而造成 Ca 2+ 释放通道结构和功能异常。当受到应激因子刺激时， Ca 2+ 大量非正常的释放，引起肌肉持续收缩因而产生 PSS 。因此， RYR1 基因的突变是导致猪应激综合征的遗传基础。许多研究者也检测到了同样的突变(Arg⁶¹⁵ →Cys)，认为和猪烷敏感性等位基因有关。 Harbitz 推测： C¹⁸⁴³ →T 突变(Arg⁶¹⁵ →Cys)改变了邻近丝氟残基(AlaValArg⁶¹⁵ Ser AsnGlnAsp)的活性，从而影响了磷酸化作用。同时， RYR1 基因 C¹⁸⁴³ →T 突变，也改变了限制性内切酶识别位点，即由 Hhal (GCG↓C ， Hal^N)，变为 HgiAI (GTGCT↓C ，halⁿ)，因此可以通过限制性内切酶酶切图谱鉴别氟烷基因型。除此之外， PSS 产生的原因还可能与肌醇三磷酸受体有关。

表 2 皮特兰和约克夏 RYR1 cDNA 和氨基酸差异